來自芝加哥大學(xué)癌癥生物研究所，本-梅癌癥研究中心等處的研究人員發(fā)明了一種能同時檢測大量蛋白的新方法，徹底改變目前我們進行癌癥和其它疾病蛋白表達水平檢測的技術(shù)面貌，這種新方法效果與傳統(tǒng)的Western Blotting一樣好，但是時間可以大大縮短，比傳統(tǒng)Western Blotting快48倍。這一研究成果公布在《Nature Methods》雜志上。
這種稱為“micro-western arrays”（微印跡分析）的方法能將蛋白檢測常用實驗：Western blot的特異識別能力，和DNA芯片檢測的高通量能力結(jié)合起來，幫助科學(xué)家們一次實驗就可以觀測到細胞中各種蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，節(jié)省了每次反復(fù)實驗的人力和物力。
領(lǐng)導(dǎo)這一研究的芝加哥大學(xué)癌癥生物研究所資深研究員Richard B. Jones表示，“蛋白才是細胞中真正的行使功能的‘儀器’，但是由于這一系統(tǒng)太復(fù)雜，所以還沒有科學(xué)家能深度剖析它們，現(xiàn)在我們終于能利用這一技術(shù)分析蛋白了。”
自上個世紀70年代以來，實驗室就開始利用Western blot方法來檢測蛋白，這種方法又稱為免疫印跡，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測，對已知表達蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。Western blot方法由于蛋白是以非共價鍵形式吸附在固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，因此能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變，從而被廣泛的用于檢測蛋白水平的表達。
這一方法導(dǎo)致了細胞生物學(xué)領(lǐng)域大量成果的涌現(xiàn)，但是仍然受限于WB實驗需要大量細胞原料和昂貴的抗體，而且這一方法也不能同時進行多個蛋白的檢測。隨著細胞網(wǎng)絡(luò)中成百上千的蛋白被發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們越來越希望能分析這些蛋白的活動，和蛋白之間的相互作用。
正如Jones博士說的那樣，“當(dāng)你走進一間黑暗的房間，如果不能獲得許多信息，那么很難去預(yù)測將會發(fā)生什么”，“如果有人點亮了燈，那么我們就不會再磕碰到物體了。”
Micro-western arrays（MWA）技術(shù)就是這樣的一盞燈，這種方法將芯片技術(shù)這種單個實驗就能檢測出上千基因的工具運用到蛋白上，利用預(yù)制的micro-western膠（包含96個微膠（miniature，生物通譯）），幫助科學(xué)家們同時比較數(shù)以百計的蛋白表達，或者一次性比較不同治療條件下蛋白的情況。而且這種方法只需要納升級細胞原料和抗體，減少了實驗成本，也**大化了單個樣品實驗?zāi)塬@得的信息。
這種MWA方法具體步驟見下圖，研究人員為了能結(jié)合微型Western Blots方法和微孔板液體操作方法，首先通過一種96孔板大小的96塊統(tǒng)一的非接觸芯片膠來預(yù)印細胞裂解物，這樣6中不同的細胞裂解物也許就能通過96個不同的抗體進行檢測，或者24個不同的裂解物通過24個不同的抗體進行檢測。為了增加大分子蛋白的轉(zhuǎn)膜率，以及降低小分子蛋白的轉(zhuǎn)膜率，研究人員使用了醋酸鹽緩沖液來跑膠。每個蛋白點，每次在膠統(tǒng)一位置加6nl樣品，反復(fù)10次，這比一次放置60nl，蛋白點密度更大，信號更好。在印跡上樣品后，研究人員將這些樣品進行半干式蛋白電泳（semidry electrophoresis），12分鐘后轉(zhuǎn)**NC膜，進行掃描檢測。
這種高通量分析技術(shù)，結(jié)合了蛋白芯片分析，將納升級的樣品點在膠上進行電泳，從而可以不同分子量的蛋白進行分離，因此效果與傳統(tǒng)的Western Blotting一樣好，但是時間可以大大縮短，包含transfer、blocking、washing、2nd antibody需要2天，數(shù)據(jù)分析約需要2-3天，整個過程大約1周的時間，比傳統(tǒng)Western Blotting快48倍。這種新的技術(shù)，可以用極少量的樣品和抗體分析大量數(shù)目不同蛋白的變化，極適合研究干細胞、癌細胞、組織發(fā)育等過程中信號傳導(dǎo)路徑（signaling transduction pathway）的變化。
研究人員將MWA技術(shù)與傳統(tǒng)的Western Blot技術(shù)進行了比較，見下圖，左邊為傳統(tǒng)的WB方法，中間為MWA方法，研究人員利用200ng/ml的EGF刺激A431細胞，然后裂解細胞，獲得裂解物，一抗β-actin單克隆抗體鼠抗（IR800 (LI-COR)二抗檢測，綠色），和多克隆抗體兔抗（Alexa Fluor 680 二抗檢測，紅色）證明了兩者的檢測效果相當(dāng)。右邊是熒光信號變化的折線圖。
研究人員也進行了驗證實驗，他們分析了一個癌細胞系中大量EGFR蛋白的情況，Jones博士說，“我們開始對這些之前從未有人進行的實驗進行驗證，這些實驗證明我們實際上同時能觀測120個靶標”。研究發(fā)現(xiàn)激活EGFR能同時激活幾種不同的細胞受體，這是一項新發(fā)現(xiàn)，解釋了為什么一些腫瘤能產(chǎn)生癌癥治療抗性。
Jones博士之前還曾合成超過500條含磷酸化酪氨酸的多肽，并且利用E. coli細菌分離數(shù)百個人類SH2- and PTB-位點包含蛋白，研究AR受體以及EGFR、MET和KIT的RTK受體被磷酸化酪氨酸后，與人類基因中含SH2-domain或PTB-domain上百個蛋白之間的相互作用。
隨著更多實驗的進行，這一方法未來也許能用于臨床癌癥和其它疾病更精確的診斷，或者用于直接個性化治療，臨床實驗受限于大多數(shù)的癌癥都是通過一種，或者兩種標記物進行檢測，這種方法容易出錯，利用MWA方法，Jones博士表示，“我們就能同時進行多種蛋白檢測，而不會僅僅局限于單個的猜想，這是之前從未能做到的。”
一些科學(xué)家也表示了對這種技術(shù)的看好，比如來自哥倫比亞大學(xué)生物醫(yī)藥信息學(xué)院的Andrea Califano就表示，“我認為這確實是一項技術(shù)突破，利用這種方法，我們就能更接近真實情況的模擬修飾后的信號蛋白，它們具有怎樣的活性，相互之間如何作用，這在目前的技術(shù)條件下是無法實現(xiàn)的”，“這打開了一扇了解細胞分子全貌的窗。”
來自都柏林大學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)主任Walter Kolch也認為，“系統(tǒng)生物學(xué)的**大難題之一就是無法獲得高密度，實時性和高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，micro-western array方法也許能**終解決這一問題”，“這是一個在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上，運用新的idea得到一種新技術(shù)的好例子。”
