Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。
一、 原理
與 Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝 酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗 體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋 白水平的表達(dá)。
二、分類
western顯色的方法主要有以下幾種：
i. 放射自顯影
ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL
iii. 底物熒光ECF
iv. 底物DAB呈色
現(xiàn) 常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用**種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行， 操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。 
三、主要試劑
1、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙 烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O**100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過(guò)7.0，因可以發(fā) 生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾。
2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。
3、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。
4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)**pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用 Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。10%(w/v)過(guò)硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.
6、 SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lán)1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解**1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。
8、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水**總量1L。
9、 麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水**100ml 用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。
10、 脫脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
12、 Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
（可以參看分子克?。?br /> 四、主要步驟
生物秀為您搜集了現(xiàn)階段幾乎網(wǎng)上所有的Western Blot的中英文資料，僅供實(shí)驗(yàn)參考，可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整：
Western Blot PROTOCOL：
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五、 實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)的問(wèn)題指南
根據(jù)問(wèn)題的類型主要分成以下幾類（以下資料權(quán)作參考，請(qǐng)勿盲目模仿?。?br />
1. 參考書(shū)推薦
A. 對(duì)初學(xué)者看什么資料比較好？
解答：《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）兩本書(shū)不錯(cuò)。

2. 針對(duì)樣品的常見(jiàn)問(wèn)題
B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡(jiǎn)寫(xiě)成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開(kāi)始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來(lái)越差，上樣量已加到120μg，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
解答：懷疑是樣品問(wèn)題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過(guò)程， 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō)，一般加PMSF就可以了，**好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
C. 細(xì)胞水平要做Western Blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠Western Blot？ 
解答：一般地5* 106就足夠了。
D. 同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白嗎，這樣對(duì)Western Blot有無(wú)影響? 
解答：能，沒(méi)有問(wèn)題，我們做過(guò)。
E. 同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎？
解答：當(dāng)然可以，有的甚**可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
F. 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時(shí)**好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
解答：你可以加大上樣量，沒(méi)有問(wèn)題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，多加5－10％甲醇。
H. 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？
解答：260kd的蛋白不好做， 分離膠用6％， Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來(lái)弱的條帶能看清楚。
解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb。
J. 蛋白變性后可以存放多久？
解答：－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。**關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。
K. 我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05ＫＤ的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。
L. 接下來(lái)我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù)，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？ 
解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用ＢＳＡ代替?yīng)該好一點(diǎn)．
M. 還有一問(wèn)題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？
解 答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開(kāi)始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng) 性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適 合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。
N. 做組織樣品的western的時(shí)候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過(guò)大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點(diǎn)？
解 答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制劑 cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體，使用ＢＳＡ也是不錯(cuò)的選擇。
O. 您是否可以介紹一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠**好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。
P. 有什么方法可以提高上樣量？
解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增大上樣量。
Q. 我要檢測(cè)的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速離心機(jī)，有沒(méi)有直接用低溫高速離心機(jī)就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞漿蛋白，用這個(gè)做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機(jī)。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的轉(zhuǎn)移方法實(shí)施。
R. 蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？
解答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等， 如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超過(guò)0.3μg/mm2。
S. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

3. 抗體
T. 做細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
解答：對(duì)二抗無(wú)要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。
U. 同一公司的另外抗體用這個(gè)稀釋度做出來(lái)效果很好，所以沒(méi)做預(yù)試，怕費(fèi)時(shí)間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，一抗孵育也是過(guò)夜的，若封閉也過(guò)夜的話就要四天才看的到結(jié)果了。
解 答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其**佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你實(shí)驗(yàn)摸索。我覺(jué)得轉(zhuǎn)膜過(guò)夜好像沒(méi)有必要吧，轉(zhuǎn)膜的目的也就是將蛋白轉(zhuǎn)到膜上 就行啦，何必浪費(fèi)時(shí)間呢。**于具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間，還要看你的目的蛋白分子量的大??；轉(zhuǎn)膜的設(shè)備，是半干式，還是濕式。一抗當(dāng)然可以過(guò)夜，如果你想所短 Western Blot時(shí)間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實(shí)驗(yàn)室一般37度，兩小時(shí)就足夠了；你可以參照抗體說(shuō)明書(shū)。**于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗 1：1500；二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時(shí)，多洗幾次，**好是在封閉；一抗和二抗后**少是5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點(diǎn)心吧，這 樣不會(huì)浪費(fèi)你的時(shí)間，只會(huì)節(jié)省你的時(shí)間！#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
V. 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
解答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未 經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受 蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和 Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說(shuō)明書(shū)上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）
W. Western Blot 中抗體的重復(fù)應(yīng)用問(wèn)題
解答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。

4. 濾紙、膠和膜的問(wèn)題
X. NC膜 PVDF膜 尼龍膜怎樣鑒別？
解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用**廣的一種固相支持物，價(jià)格**便宜；PVDF膜介于二者之間。
就 結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)480－600μg/cm2，可結(jié)合短**10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá) 80－100μg/cm2，對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng)；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)125－300μg/cm2。
就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強(qiáng)。
就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針?lè)肿涌山?jīng)堿變性被洗脫下來(lái)；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。
Y. 在做Western Blot時(shí)，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
Z. 檢測(cè)磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？
解答：可以。
AA. 轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端（即點(diǎn)樣空的一側(cè)）的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？
解答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢， 你延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。
BB. 我想問(wèn)您裂解細(xì)胞用三去污裂解法，還是用上樣緩沖液？
解答：用上樣緩沖液，這樣有幾個(gè)好處，可以提取總蛋白，同時(shí)又可以讓磷酸化酶失活。
CC. 采用tank system有什么講究？
解答：建議低電壓，長(zhǎng)時(shí)間，（一般tank System 用衡壓好點(diǎn)），如 28V 14－16hrs。
DD. 做HSP WESTEN定量，同樣的抗體免疫組化能做出，而WESTEN卻不能？
解答：這多半是抗體的問(wèn)題，要看抗體的說(shuō)明，是否能做Western Blot和IHC。
EE. 膜一般要如何處理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
FF. 如果是6×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？
解答：一抗的稀釋度是有說(shuō)明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般**少為3－5ml。
GG. 上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到**佳效果。
解答：無(wú)要求。
HH. 跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？
解 答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了。如果過(guò)夜，膠里的水分被蒸發(fā)，采用保鮮膜包上也可以； 也可能母液（30%聚丙酰胺）有問(wèn)題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找問(wèn)題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會(huì) 造成膠縮。
II. 膜、濾紙、膠大小有何講究？
解答：如果是用的是半干轉(zhuǎn)，順序?yàn)椋宏帢O－》濾紙－》膠－》膜－》濾紙。濾紙的長(zhǎng)寬分別比膠小1－2mm，而膜的長(zhǎng)寬分別比膠大1－2mm。**禁忌：上下兩層濾紙因?yàn)檫^(guò)大而相互接觸，這樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過(guò)膠和濾紙。
JJ. 蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中**66KD，大**170KD，可以一次做好嗎？
解答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAge， 濕轉(zhuǎn)36V ， 3－5hrs就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs。
KK. 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
解 答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋 白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu) 質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低**6％。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí) 間。
LL. 如何選擇**合適的蛋白雜交膜？
解答：蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中極為常用的一門技術(shù)。選擇質(zhì)量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
硝 酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力 的結(jié)合在一起，雖然這其中的機(jī)制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個(gè)特性，而且易于封閉非特異性結(jié)合，從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非離子型的去污劑作 用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越 牢固。但是膜孔徑如果小于0.1mm，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了。因此，我們通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就 可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthroμgh”的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來(lái) 看，**重要的指標(biāo)就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，市場(chǎng)上有些硝酸纖維素膜通常會(huì)還有大量的醋 酸纖維素，因而降低了蛋白的結(jié)合量。S&S公司采用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了**大的蛋白結(jié)合量，可達(dá)80-150μg/cm2。由于 100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結(jié)合，降低雜交背景，無(wú)需高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗脫步驟。其次，膜的強(qiáng)度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸纖維素膜 比較脆，漂洗一兩次就會(huì)破損，不能反復(fù)使用。
PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來(lái)制造水管的。PVDF膜可以結(jié)合蛋 白質(zhì)，而且可以分離小片段的蛋白質(zhì)，**初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測(cè)定，因?yàn)橄跛崂w維素膜在Edman試劑中會(huì)降解，所以就尋找了PDVF作為替代品，雖然 PDVF膜結(jié)合蛋白的效率沒(méi)有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測(cè)序理想的用品，一直沿用**今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進(jìn) 行各種染色和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細(xì)工藝下比常規(guī)的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢 測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進(jìn)行浸泡飽和1-5秒鐘。
離子交換型轉(zhuǎn)移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的，還有一類膜 是根據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結(jié)合陰離子基團(tuán)，包括那些高于其等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在pH10以下，DEAE基團(tuán)都能帶電荷，在低離子強(qiáng)度 的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其**適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45μm孔徑的DEAE膜，除了 可以做Western Blotting外，還可以用于核酸結(jié)合研究。
還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結(jié)合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，**適結(jié)合pH范圍在4-7。結(jié)合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來(lái)，用于氨基酸系列分析或微測(cè)序。

5. Marker的相關(guān)疑問(wèn)
MM. 我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，請(qǐng)問(wèn)什么原因？怎樣改善？膠用過(guò)8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。
解答：一般來(lái)說(shuō)，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。
NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開(kāi)始做Western Blot時(shí)還能夠看到marker，當(dāng)然也僅能看見(jiàn)其中**多三條帶。用80V進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V45min轉(zhuǎn)印的。前幾次做 Western Blot時(shí)沒(méi)有進(jìn)行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。再就是把70KD和130KD兩個(gè)目的蛋白同時(shí) 在一塊膠上進(jìn)行分析，用培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析，沒(méi)有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體（Anti-V5-HRP）。但就是出不來(lái)結(jié)果， 我很茫然。謝謝您過(guò)給予指點(diǎn)！ 
解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開(kāi)始做Western Blot時(shí)還能夠看到marker，當(dāng)然也僅能看見(jiàn)其中**多三條帶。”有的時(shí)候，Prestained Marker 放久了效果就會(huì)變差，電泳是條帶不清晰，擴(kuò)散。但是你的問(wèn)題可能還有其他的方面的問(wèn)題，可能是蛋白跟膜結(jié)合的不緊密。轉(zhuǎn)移是多加點(diǎn)甲醇。
2、“前幾次做Western Blot時(shí)沒(méi)有進(jìn)行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。”轉(zhuǎn)移時(shí)半干法建議用恒流，你這樣的也就30kd-50kd的轉(zhuǎn)移地比較好。
3、“再就是把70KD和130KD兩個(gè)目的蛋白同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行分析，用培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析，沒(méi)有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體（Anti-V5-HRP）。”
是否檢測(cè)了表達(dá)量，二抗是否是好的，你做了陽(yáng)性對(duì)照？你要做這么大的蛋白**好轉(zhuǎn)移時(shí)間延長(zhǎng)到1.5hrs。

6. 染色的選擇
OO. Western Blot哪種染色好？
解 答：（1）陰離子染料是**常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測(cè)極限可達(dá)到1.5μg，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S 和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語(yǔ)正電賀的膜。靈敏度低。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
（2）膠體金，靈敏度高，檢測(cè)范圍可到pg級(jí)，但染色比穩(wěn)定。
（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。

7. 參照的疑問(wèn)
PP. 是否Western Blot實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？
解答：對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)**好加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。
QQ. 用BANDSCAN分析結(jié)果行嗎？
解答：分析一般的結(jié)果沒(méi)問(wèn)題。
RR. 核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？
解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。
SS. 轉(zhuǎn)膜時(shí)采用電流是否比電壓準(zhǔn)確，是否根據(jù)0.8mA/cm2，一般1小時(shí)左右？
解答：不是的， 半干法推薦用恒流，一般根據(jù)目的蛋白的大小來(lái)確定電流和時(shí)間。
TT. 做半定量人卵巢癌細(xì)胞系的Western Blot，內(nèi)參B-actin，GAPDH，那個(gè)好？
解答：選用beta-actin就可以。

8. 緩沖液配方的常見(jiàn)問(wèn)題
UU. 轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉時(shí)，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來(lái)的呢？
解答：轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。Tris－HCl就是Tris鹽用HCl調(diào)ph值，配置而成。
VV. 準(zhǔn)備做大鼠腦子的Western Blot，蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核中，請(qǐng)問(wèn)此蛋白質(zhì)的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質(zhì)是磷酸化的蛋白質(zhì)，操作時(shí)如何防止去磷酸化的發(fā)生？
解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
WW. 想問(wèn)一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？
解答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來(lái)說(shuō)都沒(méi)有區(qū)別。
XX. **近作了兩次Western Blot，不但沒(méi)陽(yáng)性結(jié)果，顯色背景都沒(méi)有，電泳和轉(zhuǎn)膜都染過(guò)，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過(guò)，沒(méi)問(wèn)題。1、檢測(cè)GAD--分子量67kd， 提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不會(huì)有影響把？樣本--20度放置一周內(nèi)測(cè)。2、一抗放置2年，可能效價(jià)不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不會(huì)背景都沒(méi)有把？3、**次有不均勻背景，因?yàn)橐豢惯^(guò)夜時(shí)密封袋不均勻。后兩次無(wú)背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫 脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為 0.1%，不會(huì)是封閉液的問(wèn)題吧？
解答：可以在下面幾個(gè)問(wèn)題上找找原因。1. 封閉液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有問(wèn)題。
YY. 加甲醇的目的是什么？
解答：加甲醇起著一定的固定作用，因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)容易轉(zhuǎn)出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因?yàn)镹C膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱)。
ZZ. “轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST**后那個(gè)T是Tween嗎，濃度多大？
解 答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.
AAA. 封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒(méi)有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就在室溫里做，或者要在4度下?
解答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4度過(guò)夜。
BBB. 實(shí)驗(yàn)室暫無(wú)NP40我用sds可以嗎？另外有過(guò)用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鮮加入：65mM DTT
蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)
是用于抽提雙向電泳用蛋白的配方。不止用于抽提細(xì)胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
改 良的RIPA裂解緩沖液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%; 脫氧膽酸鈉， 0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin， 2 μg/ml)不知對(duì)于膜蛋白效果如何？此外該方中的EDTA， 是否用做蛋白酶抑制劑？
解答：做２－Ｄ**不推薦使用ＮＰ－４０（因?yàn)榧词惯M(jìn)口的 ＮＰ－４０也不純，，其中的雜質(zhì)會(huì)影響質(zhì)譜結(jié)果）。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞，其蛋白酶活性較弱（相對(duì)于組織和大腸桿菌等），可以不使用cocktail，因?yàn)?M尿 素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ構(gòu)成的變性環(huán)境已經(jīng)足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ對(duì)于抽提膜蛋白有很大的幫助，不過(guò)如果您專職做膜 蛋白建議采用分級(jí)抽提法。此外還可以采用梯度離心法和一些基于去垢劑的方法。ＥＤＴＡ用于滅活金屬蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加過(guò)多的蛋白酶抑制劑可以 導(dǎo)致蛋白質(zhì)的修飾，做ＷＢ無(wú)所謂，做ＭＡＩＬＤＩ時(shí)會(huì)給正確鑒定帶來(lái)麻煩。裂解緩沖液中少了兩性電解質(zhì)(在2-D裂解緩沖液中，兩性電解質(zhì)起的作用：提供 連續(xù)的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質(zhì)的溶解性;還可以去除一部分核酸)；也不推薦采用SDS，因SDS會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致其等電點(diǎn)發(fā)生改變，如果您實(shí) 在要用，終濃度降到0.1%以下。
CCC. Western Stripping Buffer的配方
解答：METHOD1
1、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS
二次發(fā)光protocol:1.stripping buffer洗膜：50度水浴30分鐘，搖床上搖10-20分鐘。
2、1*PBST洗：搖床上搖30分鐘。
3、封閉，加一抗，二抗（同**次發(fā)光）
METHOD2
（50ml總量）：?-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O** 50 ml。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
方法：將用過(guò)的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗3*5min就好。此時(shí)你已經(jīng)可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來(lái)再次使用了。
該方法的優(yōu)點(diǎn)：省事，省力，省錢，符合國(guó)際慣例。
METHOD3
1、beta-metaptoethanol 35ul 
2、10%SDS 1ml 
3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul 
4、dH2O 3.34ml 
50-55℃，30min。
METHOD4
stripping buffer應(yīng)該是可以放置很久的。不過(guò)我習(xí)慣于現(xiàn)配——畢竟，加了β-mercaptoethanol 以后太難聞了，配了就用；而且，有了現(xiàn)成的Tris-HCl緩沖液和SDS的母液，現(xiàn)配還是很方便的。每次用量5ml少了點(diǎn)，我每次用50ml。
METHOD5
0.5M NaCl，0.5M HAc；室溫?fù)u床15min。
METHOD6
將用過(guò)的膜泡在1*TBS中室溫振搖過(guò)夜，中間可以換液2-3次，然后封閉，加一抗，二抗（同**次發(fā)光），實(shí)踐證明方法完全可行。
不管用那種方法，洗脫后都要用PBS或TBS再洗幾次。

9. 條件的摸索
DDD. 用的是Santa Cruz的抗體，也實(shí)驗(yàn)過(guò)一抗和二抗肯定能結(jié)合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍(lán)染色沒(méi)問(wèn)題，但是不知道與Marker對(duì)應(yīng)的條帶是否是我 要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時(shí)轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的較少。難道是裂解液出了問(wèn)題？我用的是三 去污劑，但沒(méi)加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細(xì)胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克?。ǖ诙妫┥系募訕觔uffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問(wèn) 題？
解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測(cè)蛋白的濃度，一般來(lái)講，其濃度應(yīng)該在幾-20微克/微升。
2、若是蛋白沒(méi)問(wèn)題，哪就看是不是電泳的問(wèn)題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時(shí)左右。跑過(guò)積層膠與分離膠的線時(shí)，換用100V，3-4小時(shí)。
3、轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時(shí)，45分鐘足以。您所說(shuō)的大蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的，并不是真正的少，而是因?yàn)樵谔岬牡鞍字写蟮鞍妆旧砭秃苌?。我曾?jīng)也轉(zhuǎn)過(guò)2小時(shí)，但和45分鐘的區(qū)別并不大。
4、根據(jù)MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣**，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。
5、延長(zhǎng)1抗、2抗孵育時(shí)間（我曾室溫1小時(shí)，4度過(guò)夜），適當(dāng)加大1抗?jié)舛取?br /> 6、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺(jué)得質(zhì)量還可以，我想您應(yīng)該先找其他方面的原因。
EEE. 電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來(lái)了，當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問(wèn)題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。
解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑**膠的中部即可。正常條件下，電泳時(shí)溴酚藍(lán)和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時(shí)間。建議你用恒壓80－100伏。
FFF. BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有一個(gè)很致命的弱點(diǎn)就是無(wú)法控溫（我用的就是這種），當(dāng)電流過(guò)高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。
就 轉(zhuǎn)膜時(shí)，是采取恒壓還是恒流的問(wèn)題，我想和大家探討一下，我感覺(jué)我這個(gè)系統(tǒng)用恒流很容易燒膠，我的膠有68cm2，用50mA恒流來(lái)轉(zhuǎn)膜，剛開(kāi)始電壓就很 高，有20 v左右，而用恒壓，開(kāi)始電流有110mA，但15min后，電流就降到8OmA，30min后就穩(wěn)定在40mA，不就相當(dāng)于恒流嗎？
解答：恒流時(shí)電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的感覺(jué)，20V的電流30min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過(guò)我用的是小膠40cm2，不知有無(wú)不同。
GGG. 我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率（我的實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？
解答：不管怎么轉(zhuǎn)都會(huì)存在蛋白轉(zhuǎn)移不完全（電壓過(guò)小時(shí)間過(guò)短）或過(guò)度轉(zhuǎn)移（電壓過(guò)大時(shí)間過(guò)長(zhǎng)）的問(wèn)題，魚(yú)（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，下半時(shí)間短，上半時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，應(yīng)該會(huì)好一些。
HHH. 請(qǐng)問(wèn)一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？
解 答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結(jié)果較差。尼龍膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合 （注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。
III. 1、煮好后的樣品，若沒(méi)有及時(shí)上樣分離，應(yīng)如何保存，可以保存多久？2、有沒(méi)有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒(méi)有操作手冊(cè)？3、濕式轉(zhuǎn)移時(shí)是 否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恒壓轉(zhuǎn)移的條件如何確定，因?yàn)槲乙蛛x小**21KD，中**66KD，大致170KD的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移條件能夠相同 嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個(gè)濃度？書(shū)上寫(xiě)不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個(gè)線形范圍，是不是不在這個(gè)范圍內(nèi)也能分離，只是就不是 線性范圍了？#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
解答：1、煮好后的樣品，放到-20，我們?cè)谝粋€(gè)月后此樣品，效果一樣。
2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊(cè)在他們的主頁(yè)Bio-Rad USA上有。
3、轉(zhuǎn)移時(shí)一般的WATERMEN濾紙就可以。
4、轉(zhuǎn)移條件是和蛋白質(zhì)大小有關(guān)的：以次確定電壓和時(shí)間。具體可讓ptglab幫你定奪。
5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質(zhì)大小有關(guān)。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。
JJJ. 怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定**佳的條件？
解答：隨便說(shuō)一點(diǎn)， 具體的還是需要自己想：
1、在每個(gè)上樣孔里上同樣的蛋白樣品，量也一樣，**好是組織樣，（也可以跑1 個(gè)大 well， 不插梳子，多上樣，）SDS-page；
2、轉(zhuǎn)移， 設(shè)定電流或電壓；
3、每隔 1（or n） 小時(shí)，取一點(diǎn)膜染色，看轉(zhuǎn)移效果。
KKK. 我要測(cè)兩種抗體，一種為磷酸化的目的蛋白，一種為總的目的蛋白，不知道用什么方法strip**好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分鐘，似乎沒(méi)什么效果？
解答：你可以加巰基乙醇（loading buffer 一樣的濃度），56度， 30mins，看看。
LLL. 1、在用PBS洗滌抗原-抗體-ProteinA-Agarose復(fù)合物時(shí)，每次要重懸多長(zhǎng)時(shí)間合適？2、**后用2xSDS重懸抗原-抗體復(fù)合物離心后， 由于2XSDS中已經(jīng)加入了溴芬蘭，因此下面的Agarose珠子幾乎看不到，所以吸取上清加樣時(shí)也不知道里面是否吸進(jìn)了Agarose。不知有什么方法 可以解決這個(gè)問(wèn)題，或者即使吸進(jìn)了一些Agarose也不要緊呢？
解答：1、不用重懸多久，重懸起來(lái)了就可以離心了。
2、加2X BUFFER前大體上已經(jīng)知道有多少膠粒了，吸到那個(gè)位置時(shí)小心點(diǎn)就是了。我也試過(guò)一些次，首先離心稍微長(zhǎng)一點(diǎn)，長(zhǎng)20秒吧，希望膠粒能沉得結(jié)實(shí)點(diǎn)（我想 象的），再吸取。如果感覺(jué)槍頭不是很順暢的時(shí)候可能就是碰到膠粒了。很難一點(diǎn)膠粒也吸取不上來(lái)的，盡力做好就是了。
MMM. 磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？
解答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般**好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。我做的時(shí)候從未加過(guò)，都做出來(lái)了。
NNN. Western Blot中block的**短時(shí)間?
解 答：每一步1小時(shí)足夠了， 中間換抗體要洗的話多換液幾次，每次時(shí)間10分鐘就夠，洗3次只要半小時(shí)。跑膠1小時(shí)， 轉(zhuǎn)移1小時(shí)，block半小時(shí)就行，1抗1小時(shí)，洗半小時(shí)，2抗1小時(shí)，洗半小時(shí)，顯色10分鐘。一般跑兩塊膠，一塊染色， 一塊western。**肯定完事，一般不用等到第二天。
OOO. 想用Western檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的目的蛋白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品需濃縮、純化嗎？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對(duì)小分子蛋白Western blot時(shí)需特別注意哪些條件？
解答：按照你提供的濃度，如果做Western Blot，是不用濃縮樣品的. 對(duì)于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：
1、轉(zhuǎn)移時(shí)的時(shí)間，
2、轉(zhuǎn)移時(shí)的電流或電壓.
3、transfer buffer 中加20%的甲醇.
4、可以用13-15%的分離膠.
PPP. 蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉(zhuǎn)，請(qǐng)問(wèn)多大電流，多長(zhǎng)時(shí)間比較合適？
解答：分子量比較小，**好是用干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)效率太高，易轉(zhuǎn)過(guò)了。干轉(zhuǎn)的話，用2.5 A/cm2， 30min就應(yīng)該夠了。濕轉(zhuǎn)，按照bio-rad的說(shuō)明，用100mA，也得要半個(gè)多小時(shí)吧。
QQQ. 需要測(cè)同一種蛋白質(zhì)的總量與磷酸化的量，但相互間干擾太大，怎么辦？
解答：將膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巰基乙醇 100mM）中，50℃孵育30分鐘，TTBS西三次，再重新加入一抗，進(jìn)行另一種抗原的檢測(cè)。
RRR. 做Western Blot實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)膜時(shí)的電流總是偏小，轉(zhuǎn)膜的效率也偏低. 100V恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)的電流只有190mA左右，而以前都有250mA。體系和條件都和以前一樣，只是環(huán)境溫度比以前低了很多。
解答：有可能重復(fù)使用了轉(zhuǎn)移緩沖液，隨著離子的逐漸減少，電阻越來(lái)越大，當(dāng)然恒壓時(shí)電流越來(lái)越小了。建議更換轉(zhuǎn)移緩沖液。反復(fù)使用不要超過(guò)三次。環(huán)境溫度低是有利于轉(zhuǎn)移的。
SSS. 我電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來(lái)了，當(dāng) 然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問(wèn)題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。一抗我買的是單抗，推薦的稀釋度是1：100——1：1000。我用的是 1：100。難道非要用多抗嗎？按道理單抗也應(yīng)該出條帶呀！細(xì)胞用三去污劑裂解的，沒(méi)有做定量，加巰基乙醇變性后，每孔上樣20微升。提出的蛋白我保存在 4度了，這樣行嗎？
解答：1、建議您用恒壓進(jìn)行電泳，先用70V，等跑過(guò)積層膠與分離膠的界限時(shí)，換用90-100V，再跑3小時(shí)左右。2、轉(zhuǎn)膜 可用恒流，但要根據(jù)你的膜的面積及所要檢測(cè)的蛋白的分子量的大小來(lái)確定電流的大小，一般來(lái)講，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的電流大 些，譬如，你膜的面積是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的條件進(jìn)行，你就可以60mA的電流進(jìn)行。3、我覺(jué)得你的 抗體應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我們實(shí)驗(yàn)事都是保存在-20度的，提出蛋白分裝保存在-20度。
TTT. 目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細(xì)胞中mRNA表達(dá)不高，估計(jì)將培養(yǎng)上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測(cè)不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時(shí)分別管制三層凝膠，分離膠用40％T丙稀酰胺（2.6％C）濃度為16.5％，另外兩層都用30％丙稀酰胺，中間一層濃度為 10％，積層膠濃度為4％，凝膠厚度1mm，轉(zhuǎn)膜的條件試過(guò)30V70分鐘，膜上可見(jiàn)到小分子蛋白marker的條帶，似乎見(jiàn)到目的條帶，上樣量為 60μg細(xì)胞胞漿總蛋白，轉(zhuǎn)膜的條件怎么樣合適？#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
解答：一定要用0.2μm的膜，并且轉(zhuǎn)移的條件要摸索一下，小分子的Western不好做，要根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)器材來(lái)定，一般你要是有prestained marker就可以參照一下，如果相應(yīng)的分子量大小的marker轉(zhuǎn)移的好就可以了。
UUU. 怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上樣的量很重要，罐膠有什么技巧嗎？想跑漂亮，是不是應(yīng)該先小電壓，再高電壓，總體上電壓小些會(huì)跑的好些?還有前面有人說(shuō)電泳液平玻璃板會(huì)使電泳條帶漂亮些?
解 答：影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個(gè)因素：1、電壓，小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑 得很好。2、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋 上層的分離膠，使膠不均勻。
VVV. 為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時(shí)候，小分子量蛋白會(huì)丟失一些哪?什么原因?
解答：小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，會(huì)透過(guò)膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過(guò)去了。
WWW. 上次轉(zhuǎn)染了1.6*106細(xì)胞，收集，收集到了400微升體積，加6*loading buffer， 95度煮5分鐘，-20度，交替3次，離心，上樣，7%分離膠，先80v跑進(jìn)分離膠，在100v電泳**溴酚蘭出膠，biorad半干轉(zhuǎn)PDVF膜，15v 轉(zhuǎn)30分鐘，預(yù)染marker全部進(jìn)膜，轉(zhuǎn)移后的膠考馬斯亮蘭染，可見(jiàn)殘留的蛋白帶，大分子量多些.blot時(shí)，封閉用5%奶粉TTBS 1小時(shí)，抗體稀釋液TTBS，一抗(1:10，單抗上清，2000年制備)1小時(shí)，二抗(1:2000)1小時(shí)，均在室溫.結(jié)果，50kd的小分子顯 色，160kd大分子未顯色。
原因分析及準(zhǔn)備改進(jìn)：轉(zhuǎn)染大容量的質(zhì)粒(融合蛋白的質(zhì)粒)的效率會(huì)相對(duì)較低，大分子量表達(dá)也會(huì)相對(duì)較低，加上大分子 量蛋白的轉(zhuǎn)移不完全，可能是我沒(méi)有拿到大分子量條帶結(jié)果的原因。另外背景稍微有一些臟(背景整體均勻一致)，估計(jì)是二抗的濃度高了些，準(zhǔn)備降** 1:5000，另外抗體稀釋液準(zhǔn)備改用5%奶粉TTBS，封閉改為室溫2小時(shí)。這個(gè)過(guò)程有沒(méi)有問(wèn)題？
解答：首先分析你的整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。我發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)比較大的毛?。?br /> 1、一抗用TBST稀釋。按照我的理解，一抗**好用5%的TBST脫脂牛奶稀釋，和你的封閉液相一致，這樣可以降低背景。
2、 “biorad半干轉(zhuǎn)PDVF膜，15v轉(zhuǎn)30分鐘”，你是這么做的嗎？因?yàn)槲掖蟛糠謺r(shí)間是做的恒流轉(zhuǎn)移，用的是0.1mA/膜，100kd-- 200kd轉(zhuǎn)2小時(shí)。到**后電壓會(huì)升到20v左右。你用恒壓法，我不是很肯定你轉(zhuǎn)30分鐘能將大分子（160kd）的抗原轉(zhuǎn)上去。我建議你**好能將時(shí)間延 長(zhǎng)，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒壓，可摸索一下，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。有時(shí)候你的marker也有可能欺騙你，因?yàn)閙arker的量比較大，是很容易轉(zhuǎn) 上去的，實(shí)際上目標(biāo)蛋白的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于marker量。
我對(duì)你的結(jié)果分析如下：
1、你的結(jié)果很好，估計(jì)離目標(biāo)不遠(yuǎn)了，很快就可以成功。
2、 沒(méi)有160kd的帶是因?yàn)槟愕霓D(zhuǎn)移時(shí)間過(guò)短，適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間（我懷疑這是主要的問(wèn)題）。
3、你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000，背景會(huì)低一點(diǎn)。

10. 方法的介紹
XXX. 我想將hbx轉(zhuǎn)到hepg2 細(xì)胞里 通過(guò)檢測(cè)hbx蛋白的水平來(lái) 檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染的效率 不知道可不可行？
解答：Western Blot檢測(cè)HBX蛋白的表達(dá)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率不是一個(gè)好辦法，建議還是：
1、**好是帶有熒光標(biāo)簽的HBX轉(zhuǎn)染來(lái)看轉(zhuǎn)染效率，**可靠
2、其次，HBX和熒光載體共轉(zhuǎn)染，相對(duì)說(shuō)明問(wèn)題
3、熒光載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染，主要是看細(xì)胞好不好轉(zhuǎn)了呵呵
轉(zhuǎn)染效率高低熒光顯微鏡下一目了然了。有的細(xì)胞熒光強(qiáng)，有的細(xì)胞熒光弱，有的沒(méi)有。所以HBX表達(dá)強(qiáng)很可能是少數(shù)細(xì)胞熒光強(qiáng)的結(jié)果，不代表轉(zhuǎn)染效率。
YYY. 半干法轉(zhuǎn)移與膠的面積和蛋白分子兩大小好像都有關(guān)系，那么濕法轉(zhuǎn)移是不是所有的轉(zhuǎn)移條件都一樣呢？一般的條件是怎樣的？
解答：半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來(lái)算的，時(shí)間是根據(jù)蛋白分子大小定的；而濕轉(zhuǎn)的話電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定。
ZZZ. 轉(zhuǎn)膜時(shí)何為濕法，何為半干法？
解答：半干法和濕法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將膜，膠，濾紙整個(gè)浸泡在buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來(lái)做轉(zhuǎn)移體系的叫半干法。
AAAA. 為什么濃縮膠和分離膠的電壓不一致？同樣的電壓可以嗎？
解 答：濃縮膠的目的使得loading 的樣品能夠在同一條水平線上進(jìn)入分離膠 ，如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來(lái)前進(jìn)入分離膠。而在分離是理論上（實(shí)際上也是）小電壓長(zhǎng)時(shí)間分離的效果會(huì)更好，但是在操作過(guò)程中沒(méi)有必要 等那么長(zhǎng)的時(shí)間，所以就用大電壓快點(diǎn)跑。
BBBB. 如果目的蛋白比較小，21和38kd，轉(zhuǎn)膜時(shí)（Biorad的濕轉(zhuǎn)儀）時(shí)間是否能縮短些？100伏電壓，甲醇的量是否也可以相應(yīng)增加？
解答：如果是小蛋白可以用小電壓28V－36V，4－6hours，（4度）。甲醇10％－20％就可以了。

11. 結(jié)果分析
CCCC. 條帶有時(shí)清晰，有時(shí)很散，不知為何？
解答：可能原因：樣品可能存在降解；轉(zhuǎn)膜不及時(shí)造成擴(kuò)散；轉(zhuǎn)移緩沖液甲醇濃度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％）。
DDDD. 顯色目的條帶又細(xì)又淺，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，應(yīng)該是高表達(dá)。每個(gè)涌道上50-70μg蛋白，開(kāi)始用半干轉(zhuǎn)移，后來(lái)用濕轉(zhuǎn)14v，16h，用PVDF膜轉(zhuǎn)移。膠轉(zhuǎn)移后染色檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小分 子量的基本轉(zhuǎn)移走了，可是為什么條帶老是不粗不濃呢?#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
解答：可能跟你的一抗有關(guān)系，還有應(yīng)該高表達(dá)，那實(shí)際做的陽(yáng)性對(duì)照是否是高表達(dá)；還有跟抗原量相關(guān)，你多上點(diǎn)蛋白會(huì)好的多；跟顯色條件相關(guān)。
EEEE. 背景很花，當(dāng)然條帶也很淡，如果我在顯影液中多洗一會(huì)兒，背景就很深，以致無(wú)法辨認(rèn)，但有時(shí)條帶又很明顯，背底很淡。
解答：這跟你washing的時(shí)間和強(qiáng)度有關(guān)，很可能你在這方面沒(méi)有掌握好。顯影時(shí)間是有范圍的，久了肯定不行。
FFFF. 純化過(guò)的目的帶包括其上下都出現(xiàn)了色帶，而且對(duì)照菌也出現(xiàn)了條帶，會(huì)是什么原因?
解答：一抗有問(wèn)題，效價(jià)太低，且未純化；表達(dá)量太低；提蛋白時(shí)可能出了問(wèn)題。
GGGG. 做Western Blot的檢測(cè)的時(shí)候，用DAB顯色還能看出條帶，但是換成ECL的時(shí)候什么樣結(jié)果都沒(méi)有。我用的NOVA公司的發(fā)光底物，膠片是普通的X片，定影液和顯影液都是別人留下來(lái)的，不知道是什么原因？
解答：一般的說(shuō)，Ecl比DAB更靈敏，但是DAB是HRP**敏感的底物，所以有幾種可能：
ECL底物失活了，你可以檢測(cè)一下；敏感度正好不到ECl底物的范圍。DAB能顯色可不能催化ECL底物；顯影液沒(méi)用了。
HHHH. 怎樣分析結(jié)果，需要什么軟件?
解答：如果你做定量或辦定量，**少要用到一個(gè)光密度掃描分析軟件，如果不是，直接分析就可以了。
IIII. 積層膠、分離膠一般多少左右合適？
解答：一般電泳是積層膠60-80v，分離膠100v。
JJJJ. 采用生物素標(biāo)記的二抗－SABC-DAB檢測(cè)系統(tǒng)做western，非特異性的條帶和背景高？總蛋白考染的時(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很 窄，可是越靠下面的條帶越來(lái)越寬，有的跑得都連在一起了，這是什么原因，如何解決？sds－page的時(shí)候恒壓和恒流哪個(gè)好？ 
解答：非特異性的條帶和背景高：可能性太多了，一抗，二抗，封閉的原因都可能。
總蛋白考染的時(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來(lái)越寬，有的跑得都連在一起了，這是什么原因，如何解決？正常的，另外，是否是你的積層膠有問(wèn)題。sds－page的時(shí)候，恒壓和恒流都可以用。
KKKK. 血清樣品進(jìn)行Western Blot 分析，目的蛋白21kD，結(jié)果顯色出來(lái)后，目的條帶很淡，而白蛋白和IgG條帶很濃？
解 答：可能是因?yàn)榘椎鞍诪?7kD和目的蛋白相差教大，且他的濃度較低，你可以以底物二氨基聯(lián)苯胺和0．01％過(guò)氧化氫溶液顯色的時(shí)間延長(zhǎng)為30分鐘，再用 去離子水漂洗以終止反應(yīng);也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)提高封閉液的濃度，可以減少以下背景噪音。同時(shí)洗的時(shí)候要徹底，而目的條帶 弱，說(shuō)明濃度不足，如果不考慮后續(xù)功能的話，你可以過(guò)G-50（細(xì)）柱子，純化你的靶蛋白，接著真空冷凍濃縮，可以得到很漂亮的結(jié)果。
LLLL. Western轉(zhuǎn)膜已經(jīng)成功了，但是Marker泳道未見(jiàn)蛋白條帶（正常應(yīng)該有6條），其余各泳道均有清晰的蛋白條帶，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染膠，結(jié)果相同。經(jīng) 5％的脫脂牛奶封閉1小時(shí)45分鐘后，進(jìn)行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過(guò)夜，二抗孵育5個(gè)半小時(shí)（1：2000），均在室溫下，DAB顯色，雖 出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出現(xiàn)非特異性條帶。請(qǐng)問(wèn)：1、Marker是MBI公司的，可分離14-116KD的蛋白，買了大概有一年的時(shí)間，是否有問(wèn) 題？2、一抗（為多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時(shí)間是否合適？
3、封閉的時(shí)間是否太短？
解答：1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它標(biāo)稱的上樣量太少，不夠，我做過(guò)一個(gè)標(biāo)稱每次5ul可我上了20ul才行的。
2.建議，一抗4度過(guò)夜也很好， 建議1:100，室溫2hrs就夠了，
3. 二抗室溫1小時(shí)，1:2000，我喜歡4度封閉過(guò)夜（室溫2hr就夠了），1抗室溫1hr，2抗室溫1hr，**好是一抗4度過(guò)夜（或室溫2小時(shí)）1:200，2抗室溫1小時(shí)1:2000， 換ECL法。