轉(zhuǎn)膜篇

1. 轉(zhuǎn)一張膜需準備 6 張 7.0～8.3 cm 的濾紙和 1 張 7.3～8.6 cm 的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸 2 h 才可使用。

要領(lǐng)：

（1）用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水；

（2）個人感覺其實轉(zhuǎn)膜之前浸濕一下就 ok 了，沒有多大問題，可能按照上述操作結(jié)果會更好。

2. 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。

3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。在墊子上墊三層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。

要領(lǐng)：

（1）「用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡」，要領(lǐng)：一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。

（2）「在上面墊一張海綿墊」要領(lǐng)：可三張紙先疊在一起在墊于墊子上。個人感覺就墊 1 張濾紙也沒問題。

4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。

除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。

在膜上蓋 3 張濾紙并除去氣泡。**后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。

要領(lǐng)：

（1）「要在兩個邊上輕輕的反復撬」要領(lǐng)：應該邊撬邊用流水緩緩沖洗

（2）「直到撬去玻板」要領(lǐng)：撬時一定要小心，膠很易裂，要用巧勁

（3）轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。

（4）**后做成的「三明治」千萬不能形成短路，不然有可能會短路燒壞轉(zhuǎn)膜裝置（價格不菲，尤其是進口的），**次做的應請老手指教。

5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用 60 V 轉(zhuǎn)移 2 h 或 40 V 轉(zhuǎn)移 3 h。

要領(lǐng)：

（1） 實際上應該根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時間，對于小分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時**好墊兩塊硝纖膜，以免轉(zhuǎn)膜過頭。

因為如果**張膜上蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)過了，第二張膜上還有蛋白質(zhì)可以進行檢測；對于大分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時電壓要高一點，一般 80-100 V，時間也要延長一點，開始**好也用兩塊膜，特別是務必注意加強降溫措施。當然轉(zhuǎn)膜是要摸條件的，**好剛開始做的時候摸個轉(zhuǎn)膜的時間梯度。如果由于時間原因來不及做下面實驗，可以在 4 度下 12V 轉(zhuǎn)膜過夜

（2） 硝纖膜建議使用 0.22 μm 的小孔徑膜，不容易轉(zhuǎn)膜過頭；

（3） 不同的轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)移效率是不一樣的，所以換用轉(zhuǎn)膜裝置，**好再摸個條件

（4） 轉(zhuǎn)膜時電極方向注意是膜正膠負。

6. 轉(zhuǎn)完后將膜用 1×麗春紅染液染 5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。（一般不需要做這步）