電泳是實(shí)驗(yàn)室中常用的一種技術(shù)，用于根據(jù)大小分離帶電分子，例如DNA。

• 凝膠電泳是實(shí)驗(yàn)室中常用的一種技術(shù)，用于分離帶電分子，例如DNA ？，RNA ？和蛋白質(zhì)？根據(jù)它們的大小。
• 當(dāng)電流通過凝膠時(shí)，帶電分子穿過凝膠。
• 在凝膠上施加電流，以使凝膠的一端帶正電荷，而另一端帶負(fù)電荷。
• 帶電分子的運(yùn)動(dòng)稱為遷移。分子向相反電荷遷移。因此，帶負(fù)電荷的分子將被拉向正末端（相反的方向吸引！）。
• 凝膠由可滲透的基質(zhì)（有點(diǎn)像篩子）組成，當(dāng)電流通過時(shí)，分子可以穿過該基質(zhì)。
• 較小的分子在凝膠中的遷移速度更快，因此比較大的分子遷移速度更慢，因此遷移距離更短，因此較大的分子可以遷移。結(jié)果，分子按大小分開。

凝膠電泳和DNA

• 電泳使您能夠區(qū)分不同長(zhǎng)度的DNA片段。
• DNA帶負(fù)電，因此，當(dāng)電流施加到凝膠上時(shí)，DNA會(huì)向帶正電的電極遷移。
• 較短的DNA鏈比較長(zhǎng)的DNA鏈穿過凝膠的速度更快，從而導(dǎo)致片段按大小順序排列。
• 使用染料，發(fā)熒光？標(biāo)簽還是放射性的？標(biāo)記使分離后的凝膠上的DNA可見。它們將在凝膠上顯示為條帶。
• 具有已知長(zhǎng)度片段的DNA標(biāo)記通常與樣品同時(shí)在凝膠中穿行。
• 通過將DNA樣品的條帶與DNA標(biāo)記的條帶進(jìn)行比較，可以算出樣品中DNA片段的大致長(zhǎng)度。

凝膠電泳如何進(jìn)行？

準(zhǔn)備凝膠

• 瓊脂糖凝膠？通常用于可視化DNA片段。用于制作凝膠的瓊脂糖濃度取決于您正在使用的DNA片段的大小。
• 瓊脂糖濃度越高，基質(zhì)越致密，反之亦然。較小的DNA片段在較高濃度的瓊脂糖上分離，而較大的分子需要較低濃度的瓊脂糖。
• 為了制備凝膠，將瓊脂糖粉與電泳緩沖液混合并加熱至高溫，直到所有瓊脂糖粉融化為止。
• 然后將熔化的凝膠倒入凝膠澆鑄盤中，并在一端放置一個(gè)“梳子”，以制成用于移液的孔。
• 凝膠冷卻并固化后（現(xiàn)在將是不透明而不是透明的），將梳子移開。
• 現(xiàn)在，許多人都使用預(yù)制的凝膠。
• 然后將凝膠放入電泳槽中，并將電泳緩沖液倒入槽中，直到覆蓋凝膠表面為止。緩沖器傳導(dǎo)電流。所用緩沖液的類型取決于樣品中DNA片段的大致大小。

準(zhǔn)備用于電泳的DNA

• 在電泳之前將染料添加到DNA樣品中，以增加樣品的粘度，這將防止其浮出孔，從而可以看到樣品通過凝膠的遷移。
• 將DNA標(biāo)記物（也稱為大小標(biāo)準(zhǔn)品或DNA階梯）裝入凝膠的第一個(gè)孔中。標(biāo)記中的片段長(zhǎng)度已知，因此可用于幫助估計(jì)樣品中片段的大小。
• 然后將制備的DNA樣品吸移到凝膠的其余孔中。
• 完成此操作后，將蓋子放在電泳槽上，確保凝膠以及正負(fù)電極的方向正確（我們希望DNA跨凝膠遷移至正端）。

分離碎片

• 然后打開電流，使帶負(fù)電荷的DNA穿過凝膠向凝膠的正側(cè)移動(dòng)。
• 較短長(zhǎng)度的DNA移動(dòng)的速度快于較長(zhǎng)長(zhǎng)度的DNA，因此在運(yùn)行電流時(shí)移動(dòng)的距離更遠(yuǎn)。
• DNA遷移到凝膠中的距離可以通過監(jiān)視上樣緩沖液染料的遷移來直觀判斷。
• 留下的電流要足夠長(zhǎng)，以確保DNA片段在凝膠上移動(dòng)的距離足以將它們分開，但不要過長(zhǎng)以至于它們從凝膠末端流出。

用于按大小分離DNA片段的DNA電泳設(shè)備插圖。凝膠位于緩沖罐中。將DNA樣品置于凝膠一端的孔中，并且電流流過凝膠。帶負(fù)電荷的DNA向正電極移動(dòng)。圖片來源：Genome Research Limited

可視化結(jié)果

• 一旦DNA在凝膠上遷移足夠遠(yuǎn)，就將電流切斷，并將凝膠從電泳槽中移出。
• 為了使DNA可視化，用與DNA結(jié)合的熒光染料對(duì)凝膠進(jìn)行染色，然后將其放在紫外透射儀上，該透射儀將被染色的DNA顯示為亮帶。
• 或者，染料可以在倒入之前與凝膠混合。
• 如果凝膠正確運(yùn)行，將可見DNA標(biāo)記物/大小標(biāo)準(zhǔn)品的條帶模式。
• 然后可以通過想象一條橫穿DNA標(biāo)記帶的水平線來判斷樣品中DNA的大小。然后，您可以通過將它們與標(biāo)記中最接近的條帶進(jìn)行匹配來估計(jì)樣品中DNA的大小。